關鍵詞:cDNA文庫構建/EST測序分析|實驗技術服務
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cDNA文庫構建/EST測序分析|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序實驗流程：
1、mRNA在無細胞翻譯體系指導合成高分子量蛋白質的能力。無細胞翻譯系統(Cell-free translation system)，又叫體外轉錄-翻譯的偶聯系統,因為該系統需要制備無細胞提取物,還有人稱之為"溶胞粗制品翻譯系統"。
無細胞提取物的制備:
用機械的,超聲波的,滲透壓或用適當的去污劑等方法,將細胞溶破,再高速離心出去其質膜與細胞核等.該提取液中含有RNA聚合酶,核糖體,tRNA和能量發生系統.
常見的體外無細胞翻譯系統:
兔網織紅細胞系統。網織紅細胞無細胞核,其合成的蛋白質90%以上為珠蛋白.
缺 點:已含有珠蛋白mRNA.可以在該體系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去體系中的珠蛋白mRNA 。
麥胚系統用組織搗碎機將麥子搗碎,分離出麥胚.然后將粗制的麥胚加10倍體積的緩沖液與砂子共研磨.23000g離心所得的上清夜稱為S23 ;將S23分裝,保存于-20°C冰箱中.
利用麥胚系統進行蛋白質翻譯合成研究時,需加的物質與網織紅細胞系統相似.由于該體系無mRNA,所以必須加入mRNA。
優 點:適于研究mRNA,活力強,價格低廉等.
缺 點:不同制品的活性差別較大,且合成分子量較大(71X105 Dal)的蛋白質時往往提前終止.
哺乳動物mRNA在紅細胞裂解液中翻譯
2、mRNA在無細胞體系中指導合成目的多肽的能力
3、mRNA分子的大小
哺乳動物mRNA長度為500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之間.
4、總mRNA指導合成cDNA**鏈長分子的能力
利用哺乳動物細胞提取的poly(A)+RNA合成cDNA
磁珠法分離mRN
1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的總RNA和RNase-free水至終體積為500ul.
2. 65ºC加熱10分鐘。
3. 加入3ul生物素標記的Oligo(dT)和13ul20×SSC于RNA中，輕輕混合，室溫放置逐漸冷去至室溫，一般需10 分鐘左右。
4. 同時配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.
5. 將磁珠(SA-PMPs)輕晃散開，放入磁性分離架上，使SA-PMPs集中于管的一側(約30sec)，小心去上清，切不可離心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分離架集中磁珠，去除上清，重復3次。
6. 將漂洗后的SA-PMPs重新懸浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs應在30分鐘內使用。
7. 將(3)中的oligo(dT)/mRNA退火反應物全部加入含漂洗好的SA-PMPs管中，輕輕搖勻，室溫下放10 分鐘。
8. 用磁性分離架捕獲SA-PMPs,小心去上清，但不要棄去。
9. 用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs懸浮，*后一次漂洗后盡可能多的吸取水相，而不損壞SA-PMPs.
10.將SA-PMPs重新懸浮在0.1ml RNase-free水中，反復顛倒，使SA-PMPs散開，洗脫mRNA。
11.用磁性分離架捕獲SA-PMPs,將洗脫的mRNA吸入另一個新的Eppendorf管中。
12.將SA-PMPs再懸浮于0.15ml RNase-free的水中，洗脫，與(11)步洗脫液合并。
13.將得到的mRNA溶液取幾微升跑電泳，若mRNA濃度不足以進行下一步的反轉錄，則需將得到的mRNA溶液濃縮(濃縮步驟見14-18)。
14.加0.1體積的3mol/l NaAc和1.0體積的異丙醇于洗脫液中，-20ºC沉淀。
15.4ºC，13000g離心60 分鐘。去上清，加入500ul 70%乙醇混勻。
16.4ºC，7500g離心10 分鐘。
17.去上清，真空或空氣中自然風干，但不要太干，加適量RNase-free水溶解。
18.重復步驟5-12，將步驟8保留下的樣品重新上柱
注意事項:
1.所有操作均需要嚴格戴手套，戴口罩進行
2.如果total RNA質量高，雜質少，就選擇Oligotex的方法分離mRNA，相反則可以用磁珠法。
3.mRNA的電泳圖是smear。