關鍵詞:載體構建|實驗技術服務
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測序實驗流程：
設計siRNA靶序列
在制備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列.研究發現對哺乳動物細胞,*有效的siRNAs是21-23個堿基大小、3’端有兩個突出堿基的雙鏈RNA；而對非哺乳動物，比較有效的是長片段dsRNA。siRNA的序列專一性要求非常嚴謹，與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。
1.  選擇siRNA靶位點
從轉錄AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個AA 3’端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslated regions,UTRs），原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果 
2.  序列同源性分析
將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人或者小鼠、大鼠等等）進行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標序列進行合成.并非所有符合條件的siRNA都一樣有效,其原因還不清楚，可能是位置效應的結果,因此對于一個目的基因，一般要選擇3-5個靶位點來設計siRNA。
3.  設計陰性對照
一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂。當然，同樣要保證它和其他基因沒有同源性。
合成模板
1.  合成編碼 shRNA的DNA 模板的兩條單鏈，模板鏈后面接有RNA PolyIII聚合酶轉錄中止位點，同時兩端分別設計 BamH I 和 Hind III 酶切位點，可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點的 BamH I 和 Hind III 酶切位點之間。
2.  95℃，5 min，緩慢退火， DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板。