關(guān)鍵詞:慢病毒載體構(gòu)建，包裝，純化技術(shù)服務|實驗技術(shù)服務
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慢病毒載體構(gòu)建，包裝，純化技術(shù)服務|實驗技術(shù)服務——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
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測序?qū)嶒灹鞒蹋?br> 慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)和特性：整合入宿主細胞基因組，長期表達，可用于轉(zhuǎn)基因動物制備；但也有不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒的組份和特性：比逆轉(zhuǎn)錄病毒具有更高的滴度，不僅可以感染分裂期細胞，更重要的，還能感染非分裂期的細胞。利用慢病毒載體，可以研究啟動子的調(diào)控、過表達特定基因或沉默特定基因。
（一） 實驗流程（1和2為并列步驟）
1.慢病毒過表達質(zhì)粒載體的構(gòu)建
設計上下游特異性擴增引物，同時引入酶切位點，PCR(采用高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%)從模板中（CDNA質(zhì)粒或者文庫）調(diào)取目的基因CDS區(qū)（coding sequence）連入T載體。將CDS區(qū)從T載體上切下，裝入慢病毒過表達質(zhì)粒載體。
2.慢病毒干擾質(zhì)粒載體的構(gòu)建
合成siRNA對應的DNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)，退火后連入慢病毒干擾質(zhì)粒載體
3. 慢病毒載體的包裝與濃縮純化
制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后6 h 更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24和48h后，分別收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，病毒上清液通過超離心濃縮病毒。
(二) 實驗材料
2.1慢病毒載體、包裝細胞和菌株
該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達框能表達綠色熒光蛋白（GFP）。
慢病毒載體構(gòu)建包裝實驗流程如下：
1. 根據(jù)目的基因相關(guān)信息（序列，序列號等），構(gòu)建含有外源基因或siRNA的重組載體；
2. 對于測序正確的重組質(zhì)粒，提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒；
3. 使用高效重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細胞，進行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒液；
4. 濃縮、純化病毒液；
5. 用高質(zhì)量的病毒液感染細胞；
6. 通過定量PCR**測定病毒滴度（高**滴定方法）和Western 分析實驗結(jié)果；
7. 用高質(zhì)量的病毒液感染宿主細胞；檢測基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用藥物進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選，通常狀況下，篩選的細胞克隆株具有長期的表達穩(wěn)定性。病毒液足夠用于一般的動物活體實驗。